自从阿伯拉罕（KrisKristofferson饰）被吸血鬼带走，日行者刀锋（韦斯利•斯奈普斯WesleySnipes饰）就没有停止寻找这位父亲一样的老搭档，并终于在东欧将其救出。阿伯拉罕缺席的日子里，刀锋依靠新伙伴斯加德担任后勤支持。不久吸血鬼长老派人传递停战协议，只因吸血鬼中出现了新的变种——收割者，收割者同时以人类和吸血鬼为食，而且由于过快的新陈代谢导致他们需求惊人。刀锋为保全人类同意带领由长老之女内纱（LeonorVarela饰）、雪人（甄子丹饰）等组成的吸血鬼血帮部队，消灭收割者，但岂料这一切是吸血鬼的阴谋……
刀锋在布拉格寻找他的导师亚伯拉罕·惠斯勒，他在被迪肯·弗罗斯特袭击后被认为已经死亡，但实际上却变成了吸血鬼并被囚禁了两年。刀锋救出了惠斯勒（尽管他的绑架者之一拉什逃脱了）并治愈了他。惠斯勒遇到了飞毛腿，他是刀锋战士的年轻新技术人员，也是喜欢说唱音乐的吸大麻者。
一场流行病正在将吸血鬼变成“收割者”，这是一种原始的变异生物，它们对血液有着极度的渴望，并且具有高度传染性的咬伤，可以同时改变人类和吸血鬼。为了对抗收割者，吸血鬼霸主伊莱·达马斯基诺斯派他的爪牙阿萨德和女儿妮莎与刀锋达成休战，刀锋不情愿地与吸血鬼结盟。
他与血群结盟，血群是一群吸血鬼精英，最初是为了杀死他而聚集的。该包由阿萨德、妮莎、莱因哈特、丘帕、雪人、牧师、魏尔伦和她的情人光锤组成。莱因哈特讨厌刀锋，并挑战他战斗，但作为回应，刀锋在他的头上植入了一枚炸药，以保持他的秩序。
他们调查了一家吸血鬼夜总会，在那里他们遇到了收割者，并发现他们对大多数吸血鬼的弱点免疫。收割者首领贾里德·诺马克抵达并劫持了妮莎作为人质。他试图招募刀锋加入他的事业，理由是他们对吸血鬼的共同仇恨。牧师被咬伤并被仁慈杀死，而轻锤被咬伤但隐藏了咬伤。惠斯勒消失了，飞毛腿遭到几只收割者的攻击，他用紫外线灯将其赶走。刀锋与诺马克作战，诺马克对刀锋的武器免疫。
当太阳升起时，诺马克撤退，惠斯勒回来，并透露他在下水道中找到了收割者的巢穴。妮莎解剖了死去的死神，发现他们的心脏被坚固的骨头包裹着。意识到紫外线是他们唯一的弱点后，飞毛腿和惠斯勒为团队制造了紫外线武器，以及一枚足以摧毁整个巢穴的紫外线炸弹。
进入死神巢穴后，队伍分散开来。光锤变身为收割者并杀死了雪人。魏尔伦牺牲了自己，将光锤暴露在阳光下杀死了他们。丘帕攻击惠斯勒，为牧师的死报仇，但惠斯勒秘密地向空气中释放了一盒死神信息素。这吸引了一群人杀死了楚帕，惠斯勒逃脱了。
阿萨德和妮莎遭到伏击，阿萨德被杀。刀锋拯救了妮莎，并使用紫外线炸弹杀死了除诺马克以外的所有收割者。妮莎和莱因哈特设法躲避了爆炸，但妮莎受了重伤，直到刀锋允许她喝他的血才能生存。
达马斯基诺斯的部队背叛并俘虏了刀锋、惠斯勒和飞毛腿。据透露，收割者的存在是达马斯基诺人努力培育出更强大的吸血鬼品种的结果。诺马克，第一个收割者，是他自己的儿子，达马斯基诺斯认为他是一个失败者，因为他对阳光的弱点。飞毛腿透露自己是达马斯基诺斯的使魔之一，但刀锋已经怀疑这一点，并用他之前在莱因哈特身上放置的炸药杀死了他，飞毛腿认为这是一个哑弹，但刀锋秘密地用真正的炸药交换了。
达马斯基诺斯计划采集刀锋的血液，以培养对阳光的免疫力，并创造一种新的、完全无敌的吸血鬼品种。惠斯勒解开了束缚他的手铐，逃离了莱因哈特，并释放了几乎耗尽的刀锋。莱因哈特射杀了刀锋，但刀锋落入达马斯基诺斯的血池中，恢复了他的力量。他杀掉了达马斯基诺斯的追随者并杀死了莱因哈特。
诺马克进入达马斯基诺斯的据点，向他的父亲报仇。妮莎背叛了达马斯基诺斯，封锁了他们通往直升机场的逃生路线，而达马斯基诺斯在与诺马克谈判失败后被他杀死。然后诺马克咬了妮莎，喝了她的血。刀锋和诺马克展开战斗，刀锋刺伤了诺马克唯一的弱点。复仇完成后，诺马克想要结束自己的痛苦，他用刀锋之剑自杀了。为了实现妮莎作为吸血鬼而死的愿望，刀锋将她带到外面并拥抱她，而她的身体因日出而解体。稍后，在伦敦的一个脱衣舞俱乐部摊位上，从布拉格逃脱的吸血鬼拉什正在等待一个女人，刀锋出现并用刀片杀死了他。