胡迪深知自己在这个世界上的使命，就是照顾他的主人，无论是原来的安迪还是新主人邦妮。当邦妮将不情愿成为玩具的“叉叉”带回家时，胡迪又担起了教导叉叉接受自己新身份的责任。然而当邦妮将所有玩具带上房车家庭旅行时，胡迪与伙伴们将共同踏上全新的冒险之旅，领略房间外面的世界有多广阔，甚至偶遇老朋友牧羊女。在多年的独自闯荡中，牧羊女已经变得热爱冒险，不再只是一个精致的洋娃娃。正当胡迪和牧羊女发现彼此对玩具的使命的意义大相径庭时，他们很快意识到更大的威胁即将到来……
在《玩具总动员 2》和《玩具总动员 3》之间，胡迪和波比救出了安迪的遥控车RC，使其免于被暴风雨冲走，随后波和她的灯被捐赠给新主人。胡迪心烦意乱，试图营救她，但波接受了她的命运，将其视为玩具生活的一部分。伍迪试图和她一起走，但意识到安迪仍然需要他，他与博衷心告别并留下来。
九年后，即将上大学的安迪把他的玩具捐给了邦妮，胡迪很难适应，多莉在邦妮的房间里充当领导者的角色，而邦妮对和他一起玩几乎没有兴趣。伍迪坚信邦妮需要他，于是在幼儿园迎新活动当天偷偷溜进邦妮的背包。当另一个孩子偷了邦妮的美术用品时，伍迪把垃圾桶里的东西留在了邦妮的桌子上。邦妮用勺子和其他材料创造了一个娃娃，给他命名为叉子。叉叉复活了，但却遭遇了生存危机，他认为自己是垃圾，而不是玩具。随着叉子很快成为邦妮最喜欢的新玩具，伍迪不得不多次阻止他扔掉自己。
当邦妮一家人去公路旅行时，福基跳出了房车的窗户，伍迪也做了同样的事。当他们走向房车公园时，胡迪让福基相信他的位置是和邦妮在一起，福基克服了他的生存危机。当他们经过一家古董店的橱窗时，伍迪认出了波比的灯，于是绕道进去寻找她。他们遇到了一个名叫盖比盖比的会说话的洋娃娃和她的口技假人朋友，他们试图用伍迪的发声器来代替盖比损坏的发声器。胡迪逃离了商店，但福基却没有。在操场上，胡迪与波比和她的羊重聚，它们已经成为“失落的玩具”，没有任何主人，可以为所欲为，还有他们的新朋友，一个名为“失落的玩具”的微型警官玩具。吉格斯·麦克迪普斯和他们同意帮助伍迪营救叉子。
巴斯光年试图寻找伍迪，在嘉年华中迷路并成为游戏奖品，但带着毛绒玩具兔子和鸭子逃脱了。他们遇到了伍迪和波，后者带他们去了弹球机内的一个聚会场所，在那里他们找到了加拿大特技自行车玩具Duke Caboom。他们试图穿过过道跳到柜子旁来营救叉子，结果差点被店主的猫杀死。玩具们争论要回去，伍迪迫切希望对邦妮重要，无意中侮辱了波，说“丢失的玩具”无法理解忠诚。他独自一人去营救叉子，但当他面对嘉比时，嘉比向他解释说，她一生都想要一个孩子的爱。伍迪同情她，并把自己的语音盒送给了她，条件是放开叉子。
胡迪和叉基离开时，他们看到加比被店主的孙女哈莫尼冷酷地拒绝了。伍迪离开了福基，并说服盖比和他一起回到邦妮家。Bo、Caboom、McDimples、Bunny 和 Ducky 回来了（Bo 意识到伍迪是忠诚的，这样邦妮才能快乐），并帮助两人逃到游乐场。杰西在福基告知她情况后，召集邦妮的玩具接管房车控制装置并将其开往集市。当伍迪一行人接近房车时，加比注意到一个迷路的小女孩，并停下来安慰她。小女孩被父母发现，并把盖比当作她的玩具。
胡迪和波皮准备再次离开对方，但巴兹向胡迪保证，邦尼没有他也没关系，而且他可以和麦克迪普斯、卡布姆、鸭子和兔子一起作为“丢失的玩具”和波在一起。伍迪将徽章交给杰西，他的朋友们在与邦妮离开之前与他深情道别。在尾声中，“丢失的玩具”与嘉年华一起旅行，帮助珍贵的玩具找到主人，邦妮用塑料刀为叉子创造了一个同伴。